COLTIVAZIONE - Come fare le siringhe di spore
Se stai leggendo questa guida, probabilmente sei interessato alla PFTek. Le siringhe di spore sono l'inoculante più utilizzato per la PFTek. Se invece programmi di coltivare in bulk, le impronte sporali sono più facili da utilizzare, e i passaggi indicati in questa guida non sono necessari. Vediamo come creare delle siringhe di spore a partire da un'impronta sporale.
Una singola impronta sporale può produrre diverse siringhe (vedi articolo sulle spore nei link utili a fine pagina). Un'impronta sporale ben fatta, per quanto pulita, presenterà sempre una minima quantità di contaminanti (batteri, muffe, etc.) derivanti dal fatto che il fungo non è cresciuto in un ambiente sterile (pulito non è sinonimo di sterile). Di conseguenza, anche le siringhe di spore presenteranno dei microorganismi diversi dalle spore fungine. La grande quantità di spore in confronto ad altri microorganismi però garantisce che questi ultimi siano in netto svantaggio, e permette di utilizzare le siringhe con successo. Questo fatto comunque non toglie l'importanza dell'utilizzo di una buona tecnica sterile, in quanto l'introduzione di altri contaminanti a seguito di pratiche poco attente può ridurre la qualità della nostra siringa e spostare i piatti della bilancia. Più attenzione si avrà, più pulita sarà la siringa.
Occorrente
- Impronta sporale (vedi questa guida per istruzioni su come realizzarle)
- Siringa sterile (reperibile in tutte le farmacie o supermercati)
- Bicchierino o tazzina in vetro, anche una piastra Petri si può usare, se la si ha a disposizione (se non è già sterile andrà sterilizzata)
- Carta stagnola
- Still air box (vedi guida introduttiva)
- Guanti (opzionali)
- Spruzzino con acqua saponata
- Forno o pentola a pressione
- Una fiamma, opzionale, preferibilmente blu (come quella del fornello o di un accendino antivento).
Procedimento
Come prima cosa sterilizziamo il nostro bicchierino o tazzina. Il discorso è analogo alla sterilizzazione delle piastre Petri in vetro che ho descritto nella guida sull'agar. Cominciamo con l'avvolgere la tazzina con la carta stagnola in modo che una volta sterilizzata non entri in contatto con l'aria nel passaggio dal forno/pentola a pressione alla SAB.
Se abbiamo una pentola a pressione a disposizione bastano 15 minuti a 15 psi (100 kPa), 30 minuti se è una pentola europea che non arriva a 100 kPa di pressione. Nel forno circa 40 minuti a 230 gradi dovrebbero essere più che sufficienti (a seconda del tipo di forno anche meno).
Intanto che la tazzina raffredda dopo essere stata sterilizzata, prepariamo la SAB: spruzziamo le pareti con l'acqua saponata e chiudiamo eventuali porte o finestre per limitare eventuali correnti d'aria nella stanza.
Adesso mettiamo a bollire dell'acqua (va benissimo quella del rubinetto). Dall'ebollizione, aspettiamo almeno un minuto e apriamo la siringa sterile. Rimuoviamo il cappuccio (attenzione a non rimuovere anche l'ago, è facile che succeda) e aspiriamo l'acqua bollente dalla pentola. Attenzione a non sciogliere la siringa, immergete solo l'ago. Rimettete il cappuccio alla siringa piena e mettetela nella SAB a raffreddare. Ci vorrà un'oretta per le tipiche siringhe da 10 cc.
Quando tutto si è raffreddato (volendo potete fare i passaggi precedenti la sera e riprendere il giorno dopo) procediamo ad aprire - all'interno della SAB - l'involucro di stagnola con la tazzina. Se li abbiamo possiamo indossare i guanti a questo punto e disinfettarli con dell'alcool, ma non è necessario. Assicuriamoci, come al solito quando si lavora in SAB, di non passare con le mani sopra la tazzina, che è e deve rimanere sterile. Apriamo l'impronta sporale usando le stesse precauzioni e appoggiamola con il lato sterile (l'interno) rivolto verso l'alto. Prendiamo la siringa, rimuoviamo il cappuccio dell'ago, e riscaldiamo la punta su una fiamma finché non diventa rossa. Attenzione ancora una volta a scaldare solo la punta dell'ago e a non fondere la siringa (questo passaggio non è assolutamente necessario se siamo stati veloci nel riempire la siringa e richiuderla). Portiamo la siringa velocemente all'interno della SAB prima che si raffreddi, e con l'altra mano (stando sempre attenti a non passare sopra il bicchiere o l'impronta aperta) teniamo l'impronta sopra il bicchiere e “laviamola” con il contenuto della siringa. In questo modo l'acqua trasporta delle spore dall'impronta nel bicchiere. Andiamo goccia a goccia e aiutiamo delicatamente le spore a staccarsi con la punta dell'ago. Possiamo ripetere questo passaggio più volte per ogni impronta sporale.
Mettiamo da parte l'impronta sporale, quindi aspiriamo il contenuto del bicchiere/tazzina con la siringa. Abbiamo realizzato la nostra siringa di spore che potrà essere usata per la PFTek. Copriamo l'ago con il cappuccio e conserviamo in frigorifero (magari avvolte in qualcosa o dentro un contenitore) fino all'utilizzo. L'impronta sporale può essere riutilizzata per preparare altre siringhe sul momento, alternativamente la si può lasciare asciugare all'interno della SAB per poi richiuderla, ma in questo caso sconsiglio di riutilizzarla successivamente se non per l'agar.