COLTIVAZIONE - Come prendere le impronte sporali

The following text is a translation and adaptation of Bod's proper spore printing TEK. Many thanks

In questa guida si illustra la procedura per produrre impronte sporali di alta qualità, che possono essere usate per preparare le siringhe per la PFTek, per il bulk o conservate anche per lungo tempo. La tecnica che verrà descritta produce due impronte sporali da ogni fungo, di cui la seconda è la più pulita (con pochissimi contaminanti), mentre la prima è meglio pulirla su agar prima di utilizzarla.
Impronta sporale Impronta sporale Impronta sporale Impronta sporale

Occorrente

  • Still air box (vedi guida introduttiva)
  • Rotolo di carta stagnola
  • Spruzzino con soluzione di alcool al 70% o gel disinfettante per le mani
  • Spruzzino con acqua saponata
  • Bisturi o coltello affilato
  • Guanti usa e getta
  • Funghi in fase di sporulazione (il velo si è rotto, il cappello allargato e comincia ad incurvarsi verso l'alto)

La teoria

Sebbene bastino due spore per generale il micelio e anche un'impronta leggera potrebbe essere sufficiente, un'impronta più grande e scura avrà molte più spore. Questo permette di dare un vantaggio competitivo alle spore su eventuali contaminanti presenti. Immaginiamo che ci siano dieci microorganismi indesiderati sulla nostra impronta sporale (batteri o spore di muffa). È meglio avere 1'000'000 spore “buone” o 100'000'000? Ogni volta che si preleveranno delle spore si avrà un rapporto di un milione a dieci nel primo caso e 100 milioni a dieci nel secondo. Nel primo caso eventuali contaminanti sono più avvantaggiati, meglio quindi avere più spore possibili (i.e. impronte più cariche).

A volte lo scopo è preparare delle impronte da scambiare con persone che ancora non sono in grado di utilizzare l'agar, o da utilizzare per la PFTek. Verranno preparate due impronte da ogni fungo, e la seconda verrà preferita per tali circostanze. La logica è che il cappello del fungo, cresciuto e trasportato all'aria aperta (non sterile), avrà accumulato dei contaminanti. La prima impronta viene acquisita in 4-6 ore ed eventuali contaminanti si ritroveranno per la maggior parte in questa prima impronta. All'atto pratico, la prima impronta è comunque utilizzabile e relativamente pulita. La seconda impronta verrà acquisita nell'arco di 12-24 ore, tempo necessario per lo sviluppo di un'impronta molto scura e carica di spore. La seconda impronta è in teoria più pulita della prima e si presta a metodi di coltivazione più rischiosi che non prevedano l'utilizzo di agar (ad esempio per produrre le siringhe di spore per la PFTek).

Il procedimento

Funghi maturiSi parte con dei funghi in fase di sporulazione. Preparare la SAB: pulire bene l'interno, spruzzare quindi le pareti con dell'acqua saponata o con la soluzione di alcool. Spruzzare le pareti non serve a disinfettarle, ma ad assicurare che i contaminanti presenti e l'alluminio si attacchino alle pareti. Il principio alla base della SAB non è la sterilità totale, ma l'aria ferma.

Indossate dei guanti e disinfettatevi le mani con la soluzione alcolica al 70% o il gel. Coprite il pavimento della SAB con un foglio di alluminio. Mettete un secondo pezzo di alluminio sopra il primo. Il rotolo di stagnola è praticamente sterile. Il primo pezzo che abbiamo staccato era meno pulito in quanto esposto all'aria. Il secondo pezzo è quello che useremo per prendere le impronte, ed è molto pulito in quanto il primo lo proteggeva dal contatto con l'aria.

Rimuovete il cappello da ogni fungo praticando un taglio alla base con il bisturi. Rimuovere eventuali residui di velo che si trovino sotto le lamelle. Pulire bene il coltello con l'alcool, sterilizzarlo sulla fiamma ha poco senso se consideriamo che il fungo è stato cresciuto all'aria aperta, non sterile. La tecnica che useremo di doppia impronta contribuirà di più ad ottenere un'impronta pulita.

Posizionare i cappelli sul secondo foglio di alluminio, con le lamelle rivolte verso il basso. Si consiglia di coprire solo la metà inferiore del foglio di stagnola (vedi immagine sulla destra), in quanto in un secondo momento la ripiegheremo su sé stessa per sigillare le impronte. Il numero di cappelli che si potranno disporre dipenderà esclusivamente dalla dimensione della SAB.

Coprire il cappello Coprire quindi con un terzo pezzo di stagnola i funghi (vedi immagine sulla sinistra) e lasciar riposare all'interno della SAB per 4-6 ore, meglio se vicino alla parete posteriore (lontano dai buchi per le mani). Coprire i buchi della SAB durante il processo. Coprire i buchi e coprire i cappelli serve in primis ad evitare che si secchino troppo e non rilascino più spore, in secondo luogo a fornire un'ulteriore protezione da contaminanti nell'aria.

Dopo 4-6 ore, stendere un nuovo pezzo di stagnola all'interno della SAB, sul pavimento tra quello precedente e i buchi delle mani (quello di prima l'abbiamo spinto in fondo alla SAB). Rimuovete la copertura dai cappelli e spostateli sulla nuova stagnola. Congratulazioni: avete appena creato le vostre prime impronte sporali. Notate la condensa e le goccioline d'acqua che però ricoprono le impronte. Prima di poterle sigillare bisogna far evaporare tutta l'acqua che si sia raccolta. Rimettiamo al suo posto la copertura, e tagliamo un nuovo pezzo di stagnola per coprire anche i cappelli.

Le seconde impronte impiegheranno 12-24 ore per diventare abbastanza scure. Trascorso il tempo necessario, si ripiegano le prime impronte ormai asciutte (se non lo si è già fatto) e si lasciano asciugare le seconde (come per le prime, si lascia la stagnola di copertura). I cappelli utilizzati possono essere consumati o essiccati.

Schema impronte
Alla fine del processo avrete due fogli di impronte come lo schema sopra. È giunto il momento di sigillarle. Cominciate piegando a metà il foglio per coprire l'impronta.

Come piegare

Piegate tra le singole impronte e separatele (una volta segnata la piega è facile strappare l'alluminio, non è necessario usare le forbici). Una volta fatto, avrete dei quadrati/rettangoli, uno per ogni impronta. Piegate i bordi come nell'immagine: prima i due bordi laterali e poi il bordo superiore. Ora la vostra impronta può essere maneggiata senza problemi all'esterno della SAB, la parte interna sterile è protetta. Etichettate o scrivete con un pennarello indelebile la data e la varietà di cui avete preso l'impronta se prevedete di conservarle.

Note

  • La stagnola è sterile appena esce dal rotolo. Se volete tagliare già da prima i rettangoli per le singole impronte la potete sterilizzare in forno.
  • I disinfettanti sanificano. Non cercate di pulire la stagnola con alcool, candeggina o acqua ossigenata nel tentativo di sterilizzarla, non funzionerà. Verrà sanificata, ma a noi serve che sia sterile (molti meno microorganismi)
  • Come non prendere le impronteEvitate di fare più file di impronte per volta. Se proprio dovete, coprite con la stagnola dopo ogni fila, non passate con le mani (non sterili) sopra le impronte che vogliamo mantenere asettiche. Non fate come nell'immagine accanto, perché non sarete in grado di gestire le impronte e di tagliarle senza passarci sopra con mani non sterili. Prendere le impronte su file alterne vi permette di ripiegarle su sé stesse per mantenerle protette, e a quel punto le potete maneggiare con più facilità.
  • Se avete una cappa invece che una SAB, mettete le impronte il più vicino possibile alla cappa senza lasciare superficie esposta che non sia la stagnola. Questo per evitare che l'aria soffi contaminanti sulle impronte.
  • Impronta espostaPiegate sempre le impronte come indicato. Fare impronte esposte come nell'immagine le rende più difficili da usare e da mantenere pulite se si usano più volte.